ELISPOT检测：我好南？选Cytation7就对了

北京德泉发布时间：2020/02/21 09:38 点击: 加载中..

编者荐语：

自2013年北京德泉公司成为biotek公司北京、山东、辽宁、黑龙江、天津、河北的授权代理商，负责其产品的区域销售及售后等工作，通过多年的专业服务，获得了越来越多客户的信赖。我们的技术团队精益求精，旨在为您的科学探索之路提供更好的解决方案。

先聊一聊ELISPOT

ELISA想必大家都不陌生，提到ELISPOT，可能有很多童鞋还有些一知半解，今天想要和大家分享的是使用我们的智能显微镜对ELISPOT这类实验的检测和分析。

ELISPOT的大名是酶联免疫斑点实验(Enzyme linked immunospot assay)，它的出现是基于酶联免疫吸附实验的广泛发展，特别在免疫研究领域，在测定各种免疫应答相关的体液游离细胞因子(CK)和特异性抗体时，传统的ELISA方法往往显得力不从心。这是由于细胞因子分泌特性及检测灵敏度所限，使用ELISA测定过CK小伙伴，你们一定懂得。

因此在上世纪80年代，建立在细胞水平的检测特异性细胞因子和抗体的ELISPOT技术应运而生。它最大的优势在于：灵敏度超高！单细胞水平！操作方便！并且可以实现荧光多标记测定同一细胞分泌的多种细胞因子。

ELISPOT银染法的主要流程

ELISPOT和疫苗开发

当下新冠状病毒肆虐，国内针对新冠状病毒的疫苗研发也在争分夺秒的开展，在疫苗效果评价中，使用ELISPOT检测疫苗的细胞免疫功能是重要的技术手段。

中国药品生物制品检定所在 2003年发布的《预防用以病毒为载体的活疫苗制剂的技术指标原则》中指明：“使用ELISPOT方法检测淋巴细胞分泌γ干扰素功能，应该作为检测和评价疫苗的细胞免疫的有效方法”。

此外，世界卫生组织在艾滋病(HIV)疫苗的研究中，推荐使用ELISPOT检测淋巴细胞分泌γ干扰素功能（WHO-UNAIDS-sponsored training workshop 2003）。

再来谈谈IL-2

接下来分享的主要测定目标是细胞因子家族的白介素2（cytokine interleukin 2 , IL-2），它是一种由淋巴细胞分泌的多效细胞调控因子。在不同的刺激因素下，IL-2能够通过促进未成熟的T细胞向调节T细胞转化，从而防止自身免疫性疾病的发生；另外IL-2在调控T细胞分化方面也有重要作用，发挥肿瘤监视的功能。

IL-2的分泌的信号调控

我们怎么检测ELISPOT？

ELISPOT的板底材料发展经历了普通塑料板、硝酸纤维素膜（NC膜）、聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）一直到最新的荷兰U-Cytech公司的透明材质的板底。

使用PVDF膜的ELISPOT方法是目前应用最为广泛的方法，由于PVDF膜材质的不透光性，需要采用具备顶部反射光光路的显微成像进行检测，普通的显微镜自动化程度低，并不适合ELISPOT的96孔板整孔整板成像检测需求，而单独采购仅做ELISPOT的仪器，又难免资源浪费，因此，新鲜出炉的Cytation7恰恰好解决了这个矛盾~

Cytation 7的正置成像模块可以直接用于自动化全板拍摄，并通过Gen5软件分析ELISpot的斑点数目。拍摄速度：96-well ELISpot plate @ 1x: ≤5分钟

而使用透明板作为检测材质，则可以选择基于底部成像的透射光光路，因此可以选择Cytation5/Cytation1的自动化成像模块进行检测。

下面这个案例里是采用银染法ELISPOT检测IL-2的单因子测定，前期流程中的细胞孵育及洗板过程都可以用此前文章中提到的MultifuloFX或CBM系统来完成，当然如果您不嫌累可以手动操作（小编温馨提示，手动操作时一定保持优良坐姿，保护好自己的小腰椎和颈椎）。

ELISPOT的最终评定是需要通过对整个孔内的细胞斑点进行定量评估，因此需要用到自动化全孔拼接的功能。

上图展示了加入和未加入Jurkat cells 及是否加入IL-2诱导化合物的成像结果，由于银染法最终会在板底形成深色的物质，所以通过明场成像即可清晰检测到斑点的形成。BioTek的Cytation及LHFX系列成像设备均带有全自动X-Y全孔图像扫描功能，设置程序后，可进行高通量成像。

我们如何分析ELISPOT？

由于ELISPOT是一种灵敏度极高的细胞因子检测技术，所以配套的分析软件也必须给力。首先，大部分ELISPOT在染色过程中会出现非特异性着色的斑点，在Gen5 image软件对spot进行圈选的时候，可以通过我们的散点图统计分析法，设门直接剔除直径极小的非特异性着色斑点，高端操作有木有！

上图展示了Gen5图像分析软件对一个孔内spot数量和直径的散点图统计分布，由于有效分泌IL-2的细胞产生的斑点一定是比正常的细胞直径要大的，因此可以设定剔除阈值50微米，上图中鼠标直接拖动，这部分选中的细胞就OUT了！一点都不南有木有~

设定好目标参数后，我们就可以分析拟合细胞接种数量和半点计数的曲线了，上图的细胞给予联合激动剂50 ng/mL PMA，1 μg/mL Ionomycin，和 30 μg/mL PHA 处理24小时，每个点统计了8个副本，很大的工作量呢，不过反正我们有Gen5，编个程序就行了。

解锁更高端的ELISPOT技能

细胞因子参与免疫应答的过程本身是一个动态的过程，由于大部分的ELISPOT检测受到最终显色方法限制，需要手动进行时间点动力学测定，现在BioTek的智能解决方案可以提供一套基于自动化的s时间点的检测流程，只需要CBM设备，即可实现不同时间点白介素分泌的自动化检测。下图可以看出，前两个小时未检测到任何spots，而在药物刺激8~10小时候，spots的数量趋于稳定。

图的细胞给予联合激动剂50 ng/mL PMA，1 μg/mL Ionomycin，和 30 μg/mL PHA 处理，每个点统计了6个副本。

通过软件的四参数拟合，最后可以得到IL-2的联合激动曲线及使用Triptolide抑制剂的抑制曲线。

因此，采用ELISPOT分析IL-2的分泌能够具有更高的灵敏度，使用Cytation7的全自动的图像采集设备，不仅可以获得清晰的全孔图片，还能够后续通过多重图像分析获得精确的斑点定量，非常适合研究平台和筛选平台使用。

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